Next: Diverse metoder Up: Metoder Previous: Kloning i Saccharomyces cerevisiae

Subsections

Analyse av DNA-sekvens

Med DNA-sekvensering forstår vi bestemmelse av baserekkefølgen i et DNA-molekyl. Sangers kjedetermineringsmetode ligger til grunn for de fleste sekvenseringsteknikker som brukes i dag. Grunnlaget for metoden ligger i dideoksynukleotiders terminerende effekt på ulike DNA polymerasers aktivitet.

Templat (dobbelt- eller enkelttrådig DNA), primer, dNTP og en DNA polymerase uten exonuklease-aktivitet blandes med en liten andel av et dideoksynukleotid. Polymeriseringen vil terminere vilkårlig ved inkorporering av dideoksynukleotid istedet for det tilsvarende deoksynukleotid.

Separate reaksjoner for hvert av de fire nukleotidene vil gi distinkte blandinger av terminerte DNA-fragmenter som kan skilles ved elektroforetiske teknikker. Fragmentene kan detekteres ved ulike teknikker som radioaktiv eller fluoriserende merking. Bruk av fluoriserende primer eller dNTP gir mulighet for automatisering av sekvenseringen. En mye brukt fluoriserende kjemisk gruppe er Cy5, som er et indokarbocyanin (se figur 3.5)

**Figure 3.5:** Generell molekylstruktur for indokarbocyaniner
$\resizebox*{!}{0.1\textheight}{\includegraphics{bilder/metodebilder/cy5.eps}}$

Varmestabile polymeraser og PCR-teknologi har gjort sekvensering til en meget følsom teknikk med mindre strenge krav til mengde templat. Sekvenseringsreaksjonene kjøres i sykler av denaturering, annealing og elongering, som gir lineær amplifisering av terminerte fragmenter. Denne varianten av sekvensering kalles ofte ``cycle sequencing''

Prosedyre - Syklussekvensering med radioaktiv inkorporering

Prosedyren nedenfor er basert på protokollen for PERKIN ELMER`S AmpliCycle kit (#N808-0175), og gjør på bruk av [ $\alpha ^{32}$ P]-dCTP eller -dATP.

Sekvenseringsreaksjoner

1.

Tilsett for hver prøve som skal sekvenseres 2 $\mu$ l av hver av termineringsløsningene G, A, T og C til hvert sitt PCR-rør

2.

Lag en reaksjonsblanding, som vist i tabell 3.6, for hver prøve.

Table 3.6: Reaksjonsblanding syklussekvensering med radioaktivt merket primer. Man bør benytte en mengde radioaktivitet (X) som passer til mengde templat og ønsket eksponeringstid. 100 fmol templat og eksponeringstid 4-8 timer krever 2,5 $\mu$ Ci . Ta hensyn til isotopens halveringstid. Se side 13 i protokollen til PERKIN ELMER`S ``Cycle Sequencing'' kit .

Komponent	Volum ( $\mu$ l)
mQ H₂O	16-X
Primer (20 $\mu$ M)	1,0
[ $\alpha ^{32}$ P]-dCTP/ATP (10 $\mu$ Ci/ $\mu$ l)	X
10x Cycling Mix	4,0
Templat (1-100 $\mu$ M)	10,0
Totalvolum	30,0

3.

Pipetter 6 $\mu$ l av reaksjonsblandingen til hvert av de 4 tilhørende PCR-rørene fra punkt 1.

4.

Tilsett 20 $\mu$ l mineralolje dersom PCR-maskinen (programmerbar varmeblokk) som skal benyttes ikke har varme i lokket.

5.

Sett alle PCR-rørene i programmerbar varmeblokk og varm opp til 95 $\ensuremath{°}$ C i 1 minutt. Kjør deretter 25 sykluser av temperaturprogrammet vist i tabell 3.7 .

Table 3.7: Temperaturprogram syklussekvensering med radioaktivt merket primer

Trinn	Temperatur ( $\ensuremath{°}$ C)	Tid (s)
1	95	30
2	68	30
3	72	60

6.

Etter endt reaksjon tilsettes 4 $\mu$ l stoppløsning til hvert rør. Bland ved å knipse forsiktig på røret. Spinn raskt ned hvis nødvendig. Holdes kaldt.

Støping av gel

1.: Vask glassplatene og 2 spacere med destillert H₂O og deretter 70% etanol.
2.: Monter glassplatene mot hverandre med en spacer på hver side. Fest platene sammen med tape (ikke klemmer).
3.: Tilsett 12 ml Sequagel Complete til 48 ml Sequagel-6 (3.3.1.2.4) og avgass. Dette gelvolumet passer til sekvenseringsapparat fra IBI.
4.: Tilsett 400 $\mu$ l 10% APS og bland godt. Sug gelløsningen opp i en sprøyte og før den forsiktig inn mellom platene, som ligger horisontalt. Bank forsiktig ved væskefronten for å unngå bobler.
5.: Sett i kam. Fest 2 klyper over glassplatene ved kammen. La gelen polymerisere minst 1 time.

Elektroforese og eksponering

1.: Fjern kammen forsiktig og monter gelen i elektroforeseapparatet.
2.: Fyll 1xTBE i bufferkarene og spyl brønnene.
3.: Preelektroforer gelen i ca $\frac{1}{2}$ time ved 55W.
4.: Denaturer prøvene 2 minutter ved 95 $\ensuremath{°}$ C. Hold dem deretter på is.
5.: Appliser 3 $\mu$ l av hver prøve. Noter appliseringsrekkefølge.
6.: Elektroforer ved 55W i 2-3 timer. Optimal elektroforesetid avhenger av hvilket område man vil lese sekvens i.
7.: Slå av spenningen og demonter gelen. La den avkjøles 5 minutter med is på begge sider.
8.: Overfør gelen til et 3MM papir (klippet ut slik at det passer til eksponeringskassen) og skyll over med 4x 25ml 10% eddiksyre.
9.: Plasser gelen med plastfolie over på geltørker. Tørk gelen ved vakuum og 65 $\ensuremath{°}$ C i ca 1 time.
10.: Plasser 3MM papiret med tørket gel over en røntgenfilm i eksponeringskassett. Gelsiden legges mot filmens eksponerbare side. Eksponeringstid avhenger av mengde templat og radioaktivitet. 3 døgns eksponering har ofte vært brukbart til 25 fmol templat og 2,5 $\mu$ Ci radioaktivitet.

Løsninger

Nedenfor er innholdet i de kommersielle løsningene levert med ``Cycle sequencing kitet'' og gelløsningene gjengitt.

A termineringsløsning

22,5 $\mu$ M c7-dGTP
10 $\mu$ M dATP, dCTP, dTTP
600 $\mu$ M ddATP

C termineringsløsning

22,5 $\mu$ M c7-dGTP
10 $\mu$ M dATP, dCTP, dTTP
300 $\mu$ M ddCTP

G termineringsløsning

22,5 $\mu$ M 7-deaza-dGTP (c7-dGTP)
10 $\mu$ M dATP, dCTP, dTTP
80 $\mu$ M ddGTP

T termineringsløsning

22,5 $\mu$ M c7-dGTP
10 $\mu$ M dATP, dCTP, dTTP
900 $\mu$ M ddTTP

10X Cycling Mix

0,25 U/ $\mu$ l AmpliTaq DNA polymerase CS
500 mM Tris-HCl, pH 8,9
100 mM KCl
25 mM MgCl₂
0,25% (v/v) Tween 20

Stoppløsning

42,5 % Formamid
20 mM EDTA
0,05 % Bromfenolblått
0,02 % Xylene Cyanol FF

Sequagel-6

5,7% (w/v) akrylamid
0,3% (w/v) methylen-bis-akrylamid
urea (konsentrasjon ikke oppgitt, hemmeligholdt av produsenten)
0,1 M Tris-borat - 2 mM EDTA buffer (pH 8,3)

Sequagel-Complete

Innholdet hemmeligholdes av produsenten.

Prosedyre - Syklussekvensering med fluoriserende primer og automatisk sekvenator

Prosedyren som følger er basert på AMERSHAMs ``Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit'' (RPN 2436) og protokoll for bruk av PHARMACIAs ALFExpress automatiske sekvenator.

Sekvenseringsreaksjoner

Bruk Cy5-merket primer med lengde på minst 18 basepar. Primeren fortynnes til brukskonsentrasjon på 1-2 $\mu$ M. Templatet kan være enkelttrådig eller dobbeltrådig DNA av høy kvalitet. Primer bør være komplementær til et område i templatet minst 40 basepar fra starten av den ønskede sekvensen.

1.: Tin følgende av løsningenen i kitet på is (se avsnitt 3.3.1.3.5): A ,C, G, T og formamid loading buffer.
2.: Fortynn 0,5-5 $\mu$ g av hvert templat til totalt 21 $\mu$ l. Templatmengder nær øvre grense gir best sekvens.
3.: Merk 4 PCR-rør for hvert templat og tilsett 2 $\mu$ l av løsningene A, C, G og T til hvert sitt rør. Tilsett deretter 1 $\mu$ l primer (1-2 $\mu$ M) til hvert rør.
4.: Tilsett 5 $\mu$ l templat-løsning til hvert av de 4 tilhørende PCR-rørene. Bland godt. Primer og templat kan godt blandes på forhånd, for å forenkle pipetteringsarbeidet. Tilsett litt mineralolje dersom PCR-maskinen som skal benyttes ikke har varme i lokket.
5.: Kjør termosyklus-reaksjoner i PCR-maskin. Denaturer først 5 minutter ved 95 $\ensuremath{°}$ C. Deretter kjøres 25 sykler som vist i tabell 3.8.
6.: Når reaksjonen er ferdig, tilsett 3 $\mu$ l formamid loading buffer. Oppbevar prøvene på is eller ved 4 $\ensuremath{°}$ C.
7.: Før applisering på sekvenseringsgel denatureres prøvene 2 minutter ved 95 $\ensuremath{°}$ C

Table 3.8: Temperaturprogram Amersham syklussekvensering

Tid (s)	Temperatur ( $\ensuremath{°}$ C)	Aktivitet
30	95	Denaturering
30	60	Annealing og elongering

Støping av gel

Nedenfor er fremgangsmåten ved støping av sekvensgel til ALFexpress automatisk sekvenator beskrevet. Både Long Ranger akrylamid og vanlig akrylamid (se punkt 3.3.1.3.5) kan benyttes til støping av gel. Med Long Ranger gel og godt templat kan man på det beste lese opp til 1000 basepar sekvens med metoden. Vanlig akrylamidgel gir bedre oppløsning enn Long Ranger gel i området 0-300 basepar

1.: Ta ut 50 ml 6% gel-løsning fra kjøleskap og la stå i romtemperatur til den er temperert.
2.: Vask begge glassplatene og to 0,5 mm tykke spacere nøye med destillert vann og deretter 70% etanol.
3.: Påfør et meget tynt lag med Bind-Silane (se punkt 3.3.1.3.5) der hvor brønnene skal være. La tørke minst 20 minutter ved romtemperatur. Bind-Silane binder gelen kovalent til glassplatene, slik at brønnene blir mer robuste. Poler til slutt glassplatene med papir fuktet med destillert vann og fjern eventuelle fiber og støvpartikler.
4.: Monter platene med spacerne mellom. Sørg for at spacerne ligger helt ut til kanten av platene. Fest den øvre glassplaten til den nedre med 4 klemmer på hver side. Pass på at spacerne er fri for støv der hvor laser-strålen skal gå. Sett i kam øverst slik at den er helt i flukt med høyre kant sett fra forsiden av gelen.
5.: Filtrer gelløsningen med sug slik at man i tillegg oppnår en viss avgassing.
6.: Tilsett 300 $\mu$ l 10% ammoniumpersulfat-løsning og 30 $\mu$ l TEMED til gelløsningen (Long Ranger). De tilsvarende volumene for vanlig akrylamidgel er 250 $\mu$ l APS og 25 $\mu$ l TEMED. Bland godt før løsningen suges opp i en 60 ml sprøyte.
7.: Før gelløsningen forsiktig inn mellom glassplatene nedenfra mens det bankes forsiktig på den øverste glassplaten der hvor gelfronten beveger seg. Unngå bobler. Det er særdeles viktig å unngå bobler i lysveien til laseren. Sett en klemme over glassplatene ved kammen. La gelen polymerisere minst en time.

Elektroforese og datalogging

**Figure 3.6:** Prinsippet for ALFExpress sekvensering. Cy 5 merkede DNA-fragmenter detekteres av fotoceller bak gelen når de når laserstrålens lysvei. Signalene fra fotocellene plottes som funksjon av tiden. Sekvens bestemmes ut fra rekkefølgen på toppene
$\resizebox*{0.8\textwidth}{!}{\includegraphics{bilder/metodebilder/ALFEXpress1.ps}}$

Nedenfor er montering av gel, igangsettelse av elektroforese og datalogging for ALFExpress beskrevet. Prosedyren gjelder ved bruk av programvare-pakken ALFWin for MS Windows 95. Prinsippet for ALFExpress er utdypet i figur 3.6.

1.: Heng opp gelformen med polymerisert gel i ALFExpress og kobl til forsyningsslangene for temperatur-regultert vann.
2.: Sett i det nedre bufferkaret og fyll i 0,6xTBE (se avsnitt 3.3.1.3.5) buffer i øvre og nedre kar.
3.: Logg inn på PCen som brukes til å styre ALFExpress og lag din egen bruker i programmet ALFWin Admin hvis du ikke har fra før. Dette for å få resultater og loggdata til å lagres i et personlig område på disken.
4.: Start programmet ALFWin Control. Åpne her en såkalt casebook, som inneholder eksperimentelle betingelser. Man kan velge mellom ulike varianter, X-longread er mye brukt dersom man ønsker å lese langt. Den setter effekten til 25 W, temperatur i gelen til 55 $\ensuremath{°}$ C, elektroforesetiden til 15 timer og en del andre parametre. Endre på betingelsene dersom det er ønskelig.
5.: La programmet overføre de eksperimentelle paramtrene til ALFExpress ved å klikke på knappen merket ``PRESET''. Vent til temperatur og laser er justert (minst 15 minutter).
6.: Appliser 3,5 $\mu$ l av hver sekvenserings-reaksjon (denaturert på forhånd), fortrinnsvis i rekkefølgen ACGT for hvert templat. Dersom annen rekkefølge av basene benyttes må dette spesifiseres i programvaren. Følg oppmerkingen på apparatet.
7.: Monter elektroder og start elektroforesen ved å klippe på knapp merket ``START''.
8.: Informasjon om prøver, spor og lagring av resultater kan lagres mens kjøringen pågår. Velg normal prosessering som en såkalt ``post-run action''.

Evaluering av resultatene

1.: Start programmet ALFWin Evaluation
2.: Åpne filen hvor resultatene ble lagret
3.: Velg prosessering dersom dette ikke ble gjort automatisk etter kjøring. Normalprosessering brukes i de aller fleste tilfeller. Ved prosesseringen leser programvaren basesekvens ut av fluorescens-plottet. ALFEvalutation tolker rekkefølgen toppene i fluorescens-plottet som rekkefølgen av baser.
4.: Programvaren kan så benyttes til å korrekturlese og redigere den prosesserte sekvensen.

Løsninger

Nedenfor er innholdet i de kommersielle løsningene levert med ``Thermo Sequenase fluorescent labelled primer cycle sequencing kit'' (RPN 2436) fra AMERSHAM gjengitt.

Løsning A

Tris-HCl (pH 9,5)
MgCl₂
Tween 20
Nonidet P-40
2-mercaptoetanol
dATP, dCTP, dGTP, dTTP
ddATP
Termostabil pyrofosfatase
Thermo Sequenase DNA polymerase

Løsning C

Tris-HCl (pH 9,5), MgCl₂, Tween 20, Nonidet P-40 , 2-mercaptoetanol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ddCTP, Termostabil pyrofosfatase, Thermo Sequenase DNA polymerase

Løsning G

Tris-HCl (pH 9,5), MgCl₂, Tween 20, Nonidet P-40 , 2-mercaptoetanol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ddGTP, Termostabil pyrofosfatase, Thermo Sequenase DNA polymerase

Løsning T

Tris-HCl (pH 9,5), MgCl₂, Tween 20, Nonidet P-40 , 2-mercaptoetanol, dATP, dCTP, dGTP, dTTP, ddTTP, Termostabil pyrofosfatase, Thermo Sequenase DNA polymerase

Formamid loading buffer (konsentrasjoner ikke oppgitt i kit-protokollen)

Formamid
EDTA
Metylfiolett

I det følgende er oppskriften på gelløsningene og bufferne anbefalt til ALFExpress gjengitt.

6% Akrylamid gelmix

37,5 ml 40% Akrylamid
25 ml 10xTBE $\dagger$ (se nedenfor)
105g urea
H₂O til 250 ml
Lagres i kjøleskap på lystett flaske

6 % Long Ranger Akrylamid gelmix

30 ml 50% Long Ranger Akrylamid
30 ml 10xTBE $\dagger$ (se nedenfor)
105g urea
H₂O til 250 ml
Lagres i kjøleskap på lystett flaske

10xTBE $\dagger \protect$ til ALFExpress^3.8

Merk at denne oppskriften er forskjellig fra vanlig 10xTBE (beskrevet i tillegg A).
121,14 g Tris base
51,32 g borsyre
3,72 g EDTA
Filtreres gjennom 0,45 $\mu$ m filter for å unngå utfelling

Bind Silan

10 ml 100% etanol
15 $\mu$ l iseddik
2 $\mu$ l Bind-Silan

Databehandling av DNA-sekvens

Dette avsnittet behandler bruk av dataprogrammer til analyse av DNA-sekvens. Da disse metodene er av en annen karakter enn de øvrige i oppgaven, har jeg valgt å inndele beskrivelsen etter et noe annet mønster. Hver programgruppe beskrives for seg, med en forenklet prinsipiell innledning og siden en kortfattet omtale av bruken.

Søk etter homologe DNA-sekvenser med fastA og blast

Prinsipper

Programmene FastA og blast søker i databaser etter sekvenser som er homologe til en oppgitt sekvens (query). FastA søker i DNA-databaser, mens blast også kan søke i protein-databaser.

FastA søker etter likhet mellom en sekvens (query) og en gruppe sekvenser (database-sekvenser) ved hjelp av metoden til PEARSON & LIPMAN (1988) [110]. Først lager programmet en ``ordliste'' som inneholder alle mulige ``ord'' i query-sekvensen. Med ord forstår vi alle nukleotidsekvenser med lengde n, som settes av bruker. Posisjonen(e) hvor hvert ord forekommer i query-sekvensen lagres i ordlisten.

Deretter søker programmet gjennom alle DNA-sekvensene i de ønskede databasene og sammenligner hver enkelt med query-sekvensen. Hver sammenligning utføres ved at det søkes etter likhet med ordene i ordlisten. Når likhet med et ord påvises, gis det en score-verdi til sekvensen det sammenlignes med (normal score-verdi er lik for alle ord).

Etter sammenligning summeres alle de enkelte score-verdiene for en sekvens sammen. Sekvensene som gav høyest score, evalueres videre med en score-matrise som tillater konserverte utbytninger og identitet i sekvenser kortere enn ordlengden (< n). Total score for hver sekvens her lagres som init1.

Deretter undersøker programmet om noen av områdene med likheter i samme sekvens ligger inntil hverandre. En ny parameter, initn beregnes som et mål på størrelsen av de identiske strekkene. Til sist sammenstilles (alignes) query-sekvensen med de beste sekvensene så langt ved hjelp av prosedyren til CHAO, PEARSON og MILLER (1992) [111]. Sistnevnte prosedyre beregner også en parameter opt.

Programmet presenterer resultatet for bruker først ved et dotplot som viser query-sekvensen nedover og antall treff (likhet med ord i ordlisten) som funksjon av denne. Deretter listes sekvensene med høyest initn-verdi i rekkefølge sammen med sine respektive init1, initn og opt-paramaterne. Til sist vises sammenstillinger (alignments) av query-sekvensene med de beste funnene.

Med søkeprogrammet blast (basic local alignment search tool) kan query-sekvensen være enten DNA eller peptid. Det samme gjelder for databasen. Blast kan også søke i peptid-databaser med DNA-query-sekvens og motsatt. Da translaterer programmet DNA-sekvensen til peptid i alle faser før homologi-søk.

Algoritmen til blast er basert på ALTSCHUL ET AL. (1990) [112] og opererer med et begrep som kalles MSP (Maximal-scoring Segment Pairs). Et segment-par (SP) er et strekk med likhet mellom query-sekvensen og sekvensen det sammenlignes med. Blast søker å utvide segmentparene helt til likheten tar slutt. Deretter beregnes en score-verdi for segmentparet. Alle segmentpar som er store nok til at de ikke forekommer tilfeldig med en relativ frekvens større enn en forventningsverdi (expectation value), listes etter score-verdi.

Blast bruker mye kortere tid på homologi-søk enn fastA, men er mindre sensitiv. FastA er bedre i stand til å detektere homologi på tross av innsetninger, utbytninger og strekk uten idenitet internt i homologe sekvenser.

Bruk av programmene

FastA og blast er en del av gcg-pakken. Denne er tilgjengelig blant annet på serveren bioslave ved Bioteknologisenteret i Oslo. Alle kommandoer som gis i operativsystemet UNIX er her og i det følgende representert ved symbolet > og så selve kommandoen med annerledes font. Symbolet > representerer kommando-promptet og er ikke en del av kommadoen. For å oversende kommandoen til kommandotolker (shell) må return-tasten benyttes. Hjelp for alle kommandoene i gcg-pakken kan man få ved å gi kommandoen > genhelp [navn på kommando].

Fasta startest ved å gi kommandoen > fasta -batch. Batch-opsjonen gis for å la programmet gå i bakgrunnen. Da slipper man å vente mens programmet kjører (opptil flere timer). Programmet ber så om en del parametre:
- Oppgi filnavn på query-sekvensen (sekvensen man vil undersøke for homologi med database-sekvenser) når programmet. Query-sekvensen må være en gcg-fil. Resultatet av homologisøket vil bli skrevet til fil med samme navn som query-filen, men med ekstensjonen ``.fasta'' istedenfor ``.gcg''.
- Oppgi hvilken del av query-sekvensen som skal brukes til homologi-søk.
- Oppgi database(r) hvor det skal søkes for homologe sekvenser (f.eks. GeneEMBL, Genebank og EMBL).
Blast startes ved kommandoen >blast -batch. Oppgi deretter på forespørsel følgende parametre:
- Oppgi query-sekvensens filnavn (gcg-fil). Blast gir ikke muligheten til å velge ut bestemte deler av query-sekvensen.
- Oppgi databasens navn. Her gir programmet deg en liste med forslag. Velg nummeret for den ønskede databasen eller kombinasjon av databaser.
- Oppgi statistisk forventningsverdi (normalverdi=10). Treff som statistisk forventes å forekomme oftere enn denne verdien, ignoreres.
- Oppgi filnavn for resultat-utskriften.

Sammenligning av sekvenser med compare og dotplot

Prinsipper

Compare er et program som brukes til å sammenligne to sekvenser med hensyn på homologi. Det søkes for homologi ved at et ``vindu'' på et visst antall baser (oppgis av bruker) flyttes langs begge sekvensene. Programmet kan finne punkter med identitet enten ved å detektere vinduer i begge sekvenser som har et antall like nukleotider over en viss grenseverdi eller ved å detektere helt identiske vinduer i begge sekvenser. Sistnevnte variant er 1000 ganger raskere enn førstnevnte. Merk at vinduet flyttes gjennom hele den ene sekvensen for hver vindu-posisjon i den andre sekvensen.

Resultatet av sammenligningen skrives til en fil som kan brukes til å lage et todimensjonalt plot med programmet dotplot. De to sekvensene plottes på hver sin akse. Forekomster av identitet mellom sekvensene vises ved et punkt i koordinatsystemet. For eksempel vil identitet mellom vinduet som starter i posisjon 20 i den ene x-sekvensen og i posisjon 350 i y-sekvensen, symboliseres ved punktet (20,350). Fullstendig identiske sekvenser resulterer i en rett linje diagonalt i koordinatsystemet.

Bruk av programmene

Filer kan kopieres fra databaser og over til ditt filområde ved hjelp av kommandoen > fetch [filnavn]. Filene som skal sammenlignes bør ligge i samme katalog (i filsystemet), her bør man også være plassert ved start av programmene.

Start compare ved kommandoen > compare. Når programmet ber om det, oppgi navnet på de to filene som skal sammenlignes. Oppgi også størrelsen på vinduet. ( se avsnittet ovenfor) og navnet på resultatfilen.
Skriv ut et dotplot med kommandoen > dotplot [filnavn], hvor filnavn er navnet på en resultatfil laget av compare. Sørg for at riktig printer er valgt i gcg-pakken før utskrift.